19ارديبهشتسیتوژنتیک
504- .
تکنیک‌های سیتوژنتیک
سیتوژنتیک به مرور زمان پیشرفت‌های زیادی داشته است. تکامل مستمر این شاخه از علم پزشکی طی ۱۰۰ سال گذشته، تکنیک‌های بسیاری را برای تجزیهوتحلیل کروموزوم و مطالعه اختلالات کروموزومی معرفی کرده‌است.
برخی از رایج‌ترین تکنیک‌های سیتوژنتیک شامل موارد زیر هستند:
• تکنیک‌های باندینگ
• کاریوتایپینگ
آنالیزها
• تکنیک هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH)
• دورگه‌سازی ژنومی مقایسهای (CGH)
• MPLA
• CMA
تکنیک‌های باندینگ (banding techniques)
تکنیک‌های باندینگ کروموزوم، مجموعه‌ای از نشانه‌های ثابت را در طول کروموزوم‌های متافاز ایجاد می‌کنند که هم امکان شناسایی کروموزوم‌های منفرد در یک ژنوم و هم شناسایی بخش‌های خاصی از کروموزوم‌های منفرد را فراهم می‌کند. این نشانه‌ها ارزیابی نرمال بودن کروموزوم، شناسایی مکان‌های شکست و تغییرات کروموزوم، و مکان ژن‌های خاص را تسهیل می‌کنند.
روش‌های متفاوتی برای رنگ‌آمیزی در این تکنیک وجود دارد؛ از جمله این روش‌ها می‌توان به روش Q-banding ، G-banding و R-banding اشاره کرد که در ادامه به‌طور مختصر توضیحی از این موارد خواهیم داشت. در این روش‌ها الگوهای کمابیش یکسانی از باندها را در طول کروموزوم‌های انسان ایجاد می‌کند، اگرچه نوارها و مناطق چندشکلی برجسته‌شده ممکن است با هر تکنیک متفاوت باشد. این تکنیک‌ها نشانه‌های قابل تکرار در طول کروموزوم را برجسته می‌کنند و تکنیک‌های رنگ‌آمیزی تخصصی را می‌توان برای برجسته کردن مناطق خاصی از کروموزوم‌ها، مانند بخش‌های هتروکروماتیک و توالی مکرر استفاده کرد. این تکنیک‌های تخصصی، رنگ‌آمیزی ناحیه سازمان‌دهنده هسته‌ای (NOR)، رنگ‌آمیزی هتروکروماتین سانترومریک (C-banding)رنگ‌آمیزی DNA ماهواره‌ای متیله (distamycin-DAPI banding) و نوارسازی تکرار را نیز شامل می‌شوند.
(G Banding) GTL-banding:
این روش رنگ‌آمیزی گیمسا برای شناسایی کروموزوم‌های فردی و ناهنجاری‌های ساختاری آن‌ها با توجه به الگوی نواری حاصل استفاده می‌شود. باند G به‌طور گسترده در عمل بالینی استفاده می شود زیرا نوارهای دائمی مجزایی را تولید می‌کند که امکان شناسایی همه کروموزوم‌های انسانی و مشخص کردن دقیق ناهنجاری‌های عددی و ساختاری را فراهم می‌کند.
(Q Banding) QFQ-banding:
این روش رنگ‌آمیزی فلورسنت، که از کویناکرین استفاده می‌کند، برای شناسایی کروموزوم‌های فردی و ناهنجاری‌های ساختاری آن‌ها، با توجه به الگوی نواری ایجاد شده، استفاده می‌شود. برای شناسایی دقیق هر کروموزوم می‌توان از الگوی نواری مشخصه استفاده کرد.
رنگ‌آمیزی دیستامایسین-A/DAPl:
این روش رنگ‌آمیزی مناطق هتروکروماتیک موجود در کروموزوم‌های 1، 9، 15، 16 و Y را شناسایی می‌کند.
CBL-banding(c باند):
این روش رنگ‌آمیزی برای تجزیهوتحلیل تغییرات ساختاری طبیعی و غیرطبیعی در کروموزوم‌ها با مکان‌یابی هتروکروماتین سازنده سانترومر و Yq استفاده می‌شود.
رنگ‌آمیزی :AgNOR برای مناطق ماهواره‌ای رنگ‌آمیزی نقره‌ای نواحی سازمان‌دهنده هسته‌ای (AgNOR) برای مکان‌یابی مناطق سازمان‌دهنده هسته‌ای روی کروموزوم‌ها استفاده می‌شود. این برای مطالعات کروموزوم‌های دارای ماهواره‌های دوتایی، پلی‌مورفیسم‌های کروموزوم و ناهنجاری‌های ساختاری مربوط به مناطق ماهواره‌ای مفید است.
بدون باند( Nonbanding):
این روش باندینگ کروموزوم از رنگ‌های نوکلئوپروتئینی مانند Geimsa برای تولید کروموزوم‌های رنگ‌آمیزی یکنواخت استفاده می‌کند .به‌طور معمول، 20 متافاز توسط nonbanding رنگ‌آمیزی‌شده و برای ناهنجاری‌های جزئی، مانند شکستگی‌ها و شکاف‌های کروماتید تجزیهوتحلیل می‌شوند. ناهنجاری‌های عمده، مانند قطعات غیرمرکزی و کروموزوم‌های دو مرکز و پیکربندی‌های شعاعی، مانند سه شعاعی، چهار شعاعی و سازندهای شعاعی پیچیده.
تکنیک کاریوتایپ
کاریوتایپینگ فرآیند جفت‌شدن و مرتب کردن همه کروموزوم‌های یک ارگانیسم است، بنابر این یک عکس فوری ژنومی از کروموزوم‌های فرد ارائه می‌کند. کاریوتایپ با استفاده از روش‌های رنگ‌آمیزی استاندارد‌شده، تهیه می‌شود که ویژگی‌های ساختاری مشخصی را برای هر کروموزوم نشان می‌دهد. سیتوژنتیک بالینی، کاریوتایپ‌های انسانی را برای تشخیص تغییرات ژنتیکی فاحش - ناهنجاری‌هایی که چندین مگا باز از DNA یا بیشتر را شامل می‌شود، تجزیهوتحلیل می‌کنند. کاریوتایپ‌ها تغییرات در تعداد کروموزوم‌های مرتبط با شرایط آنیوپلوئیدی، مانند تریزومی 21 (سندرم داون) را نشان دهند. تجزیهوتحلیل دقیق کاریوتایپ‌ها، تغییرات ساختاری ظریف‌تری مانند حذف کروموزومی، تکرار، جابه‌جایی یا وارونگی را نشان می‌دهد. در واقع، همان‌طور که ژنتیک پزشکی به‌طور فزاینده‌ای با پزشکی بالینی ادغام می‌شود، کاریوتایپ‌ها نیز به منبع اطلاعات تشخیصی برای نقایص خاص مادرزادی، اختلالات ژنتیکی و حتی سرطان تبدیل می‌شوند.
آنالیز
CMA (تجزیهوتحلیل ریزآرایه کروموزومی):
این تست توانایی سیتوژنتیک بالینی در بررسی ژنوم انسان را افزایش داده‌است به گونه‌ای که در حال‌حاضر جایگزین کاریوتایپ است و همانند FISH، تست تشخیصى در افراد داراى تاخیر تکاملى یا نارسایى ذهنى بدون علت، گستره‌ی اختلال اوتیسم یا ناهنجاری‌هاى مادرزادى متعدد است. (CMA) یک فناوری است که برای تشخیص ریز حذف‌ها یا تکرارهای بالینی مهم با حساسیت بالا برای انحرافات زیر‌میکروسکوپی استفاده می‌شود.
تجزیهوتحلیل ریزآرایه کروموزومی(CMA) یک فناوری است که برای تشخیص ریزگردها یا تکرارهای بالینی مهم استفاده می شود. این آنالیز می‌تواند تغییراتی به اندازه ۵ تا ۱۰ کیلوبایت را تشخیص دهد - وضوحی تا ۱۰۰۰ برابر بیشتر از کاریوتایپینگ معمولی. CMA برای کشف واریانت‌های تعداد کپی (CNV) استفاده می‌شود که تصور می‌شود نقش مهمی در پاتوژنز انواع اختلالات، در درجه اول اختلالات عصبی رشدی و ناهنجاری‌های مادرزادی دارند. CMA ممکن است در شرایط قبل از تولد یا پس از زایمان، با مزایا و محدودیت‌های منحصر به‌فرد در هر شرایط اعمال شود. استفاده روزافزون از CMA درک اصول این فناوری و آگاهی از قدرت‌ها و محدودیت‌های آن را برای پزشکان متخصص ضروری می‌کند.
MPLA:
تقویت پروب وابسته به بستن چندگانه(Multiplex ligation-dependent probe amplification) روشی است که با انجام یک واکنش ساده PCR، با استفاده از یک جفت پرایمر PCR، اعداد کپی نابجا را در حداکثر ۶۰ توالی اسیدنوکلئیک خاص شناسایی می‌کند که برای تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی کوچک خاص استفاده می‌شود. تکنیک MLPA تنها به ۵۰ نانوگرم DNA کروموزومی انسان برای تشخیص نیاز دارد. از جمله کاربردهای این تکنیک عبارت‌اند از: تشخیص حذف یا تکثیر اگزون در به‌عنوان مثال ژن‌های BRCA1،MSH2 و MLH1 انسانی، تشخیص تریزومی‌هایی مانند سندرم داون، شناسایی ناهنجاری‌های کروموزومی در رده‌های سلولی و نمونه‌های تومور، تشخیص SNP و جهش، و تجزیهوتحلیل متیلاسیون DNA.
هیبریداسیون فلورسنس درجا (FISH)
فرآیندی است که کروموزوم‌ها یا بخش‌هایی از کروموزوم‌ها را با مولکول‌های فلورسنت رنگ می‌کنند، تا ناهنجاری‌های کروموزومی (مانند درج‌ها، حذف‌ها، جابه‌جایی‌ها و ...) را شناسایی کنند. FISH معمولاً برای شناسایی حذف‌های کروموزومی خاص مرتبط با سندرم های کودکان مانند سندرم دی جورج (حذف بخشی از کروموزوم 22 ) و سرطان‌هایی مانند لوسمی میلوژن مزمن (جابه‌جایی کروموزوم های 9 و 22) استفاده می‌شود؛ زیرا در شناسایی محل قرارگیری یک ژن خاص در کروموزوم‌های فرد کمک می‌کند.
اولین قدم، تهیه توالی‌های کوتاهی از DNA تک رشته‌ای است که با بخشی از ژن مورد نظر محقق مطابقت دارد که پروب نامیده می‌شوند. مرحله بعدی این است که این پروب‌ها را با یکی از رنگ فلورسنت نشانه‌گذاری کنیم. از آنجایی که پروب‌های تک رشته‌ای هستند، می‌توانند به رشته مکمل DNA در هر کجای کروموزوم های فرد که قرار داشته باشد، متصل شوند. هنگامی که پروب به کروموزوم متصل می‌شود، از آنجایی که با فلورسنت نشاندار شده، تشخیص لکوس را برای محقق آسان می‌کند.
هیبریداسیون ژنومیک مقایسهای (CGH)
تکنیکی است که امکان تشخیص تغییرات تعداد کپی کروموزومی را بدون نیاز به کشت سلولی فراهم می‌کند. هیبریداسیون مقایسهای ژنومی (CGH)، ابزاری جایگزین به منظور غربالگری گسترده ژنوم برای تغییرات تعداد کپی فراهم می‌کند. CGH اولین بار برای تشخیص تغییرات تعداد کپی در تومورهای جامد ساخته شد. بدین منظور از دو ژنوم، یکی نمونه آزمایش و یکی به عنوان کنترل استفاده می‌شود که به‌طور متفاوت نشانه‌گذاری شده و با کروموزوم‌های متافازی هیبرید می‌شوند. سپس شدت سیگنال فلورسنت DNA آزمایش نشاندار شده نسبت به DNA مرجع می تواند به صورت خطی در هر کروموزوم رسم شود و امکان شناسایی تغییرات تعداد کپی را فراهم می‌کند.
هیبریداسیون مقایسه ای ژنومی آرایه (aCGH)
یک تکنیک مبتنی بر ریزآرایه برای تشخیص تغییرات در توالی DNA ژنومی است و به‌طور گسترده‌ای برای تحقیقات بالینی در زمینه سیتوژنتیک پایه، بیماری‌های نادر، سرطان و سلامت باروری استفاده می‌شود.
این تکنیک شامل نشانه‌گذاری یک نمونه DNA آزمایشی (نمونه بیمار) و یک DNA مرجع (شاهد) با سیانین۳ و سیانین۵، رنگ‌های فلورسنت سبز و قرمز است. پس از نشانه‌گذاری، نمونه‌های DNA مرجع و آزمایش با هم مخلوط می‌شوند و روی یک ریزآرایه شامل ده‌ها هزار توالی DNA کوتاه که نشان‌دهنده مناطق ژنوم است، بارگذاری می‌شوند. نمونه‌های تلفیقی به‌طور رقابتی با پروب‌های DNA روی آرایه هیبرید می‌شوند. رنگ فلورسنت برای تشخیص شدت سیگنال نسبی استفاده می‌شود و وجود تفاوت‌ها، کم و زیاد بودن تعداد کپی بین نمونه‌ها را برجسته می‌کند. هیبریداسیون مقایسهای ژنومی (aCGH)، وضوح بالا و تجزیهوتحلیل گسترده ژنومی را برای تشخیص آنوپلوئیدی‌های کل کروموزوم، حذف‌های زیر میکروسکوپی و تکثیر تا وضوح تک اگزون و کپی رویدادهای خنثی مانند از دست دادن هتروزیگوسیتی (LoH) و دایزومی تک والدی ارائه می‌دهد.